Δοκίμιο ABTS
Πρόκειται για μια αναλυτική μέθοδο που χρησιμοποιεί φασματοφωτομετρική μέτρηση για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας ενός δείγματος. Χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV-Vis, μετριέται η απορρόφηση ενός διαλύματος που περιέχει τη ρίζα ABTS • +, που παράγεται με οξείδωση του ABST (2, 2'-αζινοδις (3-αιθυλοβενζοθειαζολιν-6-σουλφονικού) οι ρίζες είναι χρωματισμένες απορροφώντας τα χαρακτηριστικά μήκους κύματος στο ορατό εύρος. Η προσθήκη στο διάλυμα των ABTS • + αντιοξειδωτικών μορίων, τα οποία μπορούν να δράσουν με μεταφορά τόσο υδρογόνου όσο και ηλεκτρονίου, καθορίζει τη μείωση της ρίζας στην άχρωμη μορφή, με επακόλουθο αποχρωματισμό του μείγματος αντίδρασης. Αυτή η λεύκανση, ανάλογη με την ποσότητα του αντιοξειδωτικού που υπάρχει, μπορεί να μετρηθεί ως μείωση της απορρόφησης σε ένα συγκεκριμένο χρόνο σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος (734 nm). Η αντιοξειδωτική ενέργεια εκφράζεται σε σύγκριση με οι τιμές απορρόφησης που μετρήθηκαν για γνωστές ποσότητες ενός αντιοξειδωτικού μορίου που επιλέχθηκε ως πρότυπο αναφοράς, το οποίο είναι συνήθως ασκορβικό οξύ ή Trolox (στην περίπτωση αυτή μιλάμε για αντιοξειδωτική δραστικότητα TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity.
Η μέτρηση της αντιοξειδωτικής ισχύος που βασίζεται στη χρήση του ABTS έχει το πλεονέκτημα ότι είναι απλή και γρήγορη. Επιπλέον, επιτρέπει τη μέτρηση των αντιοξειδωτικών ουσιών τόσο υδρόφιλων όσο και λιποφιλικών σε ευρεία κλίμακα ρΗ. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι η χρησιμοποιούμενη ρίζα (ABTS • +) δεν είναι φυσιολογική και δεν υπάρχει στα βιολογικά συστήματα και ότι συχνά επισημαίνονται τα προβλήματα επαναληψιμότητας της μέτρησης λόγω της κινητικής αντίδρασης των διαφόρων αντιοξειδωτικών.
FRAP (αντιοξειδωτική δύναμη που μειώνει τη σίδηρο)
Η δοκιμή FRAP μετρά τη μειωτική ικανότητα των αντιοξειδωτικών έναντι ιόντων σιδήρου. Πρόκειται για μια μέθοδο που βασίζεται στη μεταφορά ηλεκτρονίων, στην οποία τα ιόντα σιδήρου περνούν από Fe3 + σε Fe2 +. Υπό ορισμένες συνθήκες ρΗ (3.6) και παρουσία ΤΡΤΖ (2, 4, 6-τρις (2-πυριδυλο) -δ-τριαζίνης), αυτά τα ιόντα σχηματίζουν σύμπλοκα με διαφορετικά χαρακτηριστικά, συγκεκριμένα το μειωμένο παράγωγο (Fe2 + -ΤΤΤΖ) υποθέτει ένα μπλε χρώμα που έχει μέγιστη απορρόφηση στα 593 nm που μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά. Η μειωτική ικανότητα μιας αντιοξειδωτικής ουσίας μπορεί ως εκ τούτου να μετρηθεί ως μία μεταβολή στην απορρόφηση του διαλύματος που περιέχει το οξειδωτικό στο μήκος κύματος που καθορίστηκε σε σύγκριση με τη μεταβολή σε σχέση με ένα πρότυπο (π.χ. ασκορβικό οξύ).
Το τεστ FRAP σχεδιάστηκε για να μετρήσει τη μειωτική ισχύ του πλάσματος, αλλά στη συνέχεια προσαρμόστηκε για να ελέγξει την αντιοξειδωτική ικανότητα καθαρών ενώσεων και σύνθετων μητρών. Στην πραγματικότητα, δεδομένου ότι αυτή η μέθοδος επιτρέπει την αξιολόγηση μόνο της μειωτικής ικανότητας με μεταφορά ηλεκτρονίων, αγνοώντας εντελώς τη δράση των αντιοξειδωτικών που δρουν μέσω μεταφοράς υδρογόνου, δεν επιτρέπει τη μέτρηση της συμβολής μορίων, όπως οι θειόλες και οι πρωτεΐνες, που παίζουν αντιοξειδωτικό ρόλο θεμελιώδη σε βιολογικά υγρά (π.χ. αίμα). Το πλεονέκτημα στη χρήση αυτής της μεθόδου είναι ότι είναι μία από τις απλούστερες, ταχύτερες και λιγότερο ακριβές μεθόδους για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας in vitro.
ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ DPPH
Το 2, 2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζύλιο (DPPH •) είναι μια πολύ σταθερή και εμπορικά διαθέσιμη ρίζα αζώτου, χαρακτηριζόμενη από έντονο πορφυρό-κόκκινο χρώμα, το οποίο σβήνει όταν μειώνεται παρουσία ενός μορίου με αντιοξειδωτική ικανότητα. Με τη φασματοφωτομετρική μέτρηση στα 517 nm της μεταβολής της απορρόφησης του διαλύματος DPPH μετά από αντίδραση με μια αντιοξειδωτική ένωση, είναι δυνατόν να ποσοτικοποιηθεί η μειωτική ικανότητα της ελεγχόμενης ουσίας είτε ενεργεί με μεταφορά υδρογόνου είτε με μεταφορά ηλεκτρονίων. Το αποτέλεσμα εκφράζεται γενικά ως IC50, δηλ. Η ποσότητα αντιοξειδωτικού που μπορεί να μειώσει την αρχική συγκέντρωση DPPH κατά 50%.
Πρόκειται για μια γρήγορη, απλή και ανέξοδη μέθοδο. Τα όρια αυτής της αναλυτικής τεχνικής δίδονται από την πιθανότητα να διαστρεβλωθούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης στην περίπτωση κατά την οποία τα εξεταζόμενα μόρια απορροφούν στο ίδιο εύρος μήκους κύματος της DPPH ρίζας ή παρουσία μεγάλων μορίων συστελλόμενων στερικά που δεν έρχονται να αντιδράσουν με το αντιδραστικό μέρος της ριζοσπαστικής. Αυτό αναγκάζει το DPPH να αντιδράσει με αντιοξειδωτικά μέχρι 1000 φορές αργότερα από τις ρίζες υπεροξυλίου.
PCL TEST (Φωτοχημειοφωταύγεια)
Η δοκιμή PCL βασίζεται στην αντίδραση ειδικού ριζικού είδους, το ανιόν υπεροξειδίου (O2 - -), που παράγεται φωτοχημικά με υπεριώδη ακτινοβολία, με ένωση ικανή να εκπέμπει χημειοφωταύγεια. Ο χρησιμοποιούμενος δείκτης είναι η λουμινόλη, ένα μόριο που όταν οξειδώνεται από ελεύθερες ρίζες εκπέμπει φως που μπορεί να μετρηθεί χρησιμοποιώντας ένα ειδικό όργανο (Photochem®). Η παρουσία αντιοξειδωτικών ουσιών στο μίγμα σιτηρών απενεργοποιεί το ριζικό είδος που αναστέλλει την εκπομπή χημειοφωταύγειας. Η ανάλυση PCL είναι πολύ γρήγορη και ευαίσθητη. Επιπλέον, με την εφαρμογή δύο διαφορετικών αναλυτικών πρωτοκόλλων, που ονομάζονται ACW (Αντιοξειδωτική Χωρητικότητα Διαλυτό στο Υδατικό) και ACL (Αντιοξειδωτική Χωρητικότητα Διαλυτό Λιπιδίων), μπορεί να μετρηθεί η συνεισφορά στη συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του υδατοδιαλυτού συστατικού (φλαβονοειδή, βιταμίνη Ε) για την ίδια ένωση. C, αμινοξέα κ.λπ.) από το λιποδιαλυτό (τοκοφερόλες, τοκοτριενόλες, καροτενοειδή, κλπ.). Η αντιοξειδωτική ικανότητα του υπό εξέταση προϊόντος λαμβάνεται συγκρίνοντας τις τιμές που καταγράφηκαν με τις μετρήσεις που σχετίζονται με πρότυπα μόρια αναφοράς, το ασκορβικό οξύ για το πρωτόκολλο ACL και το Trolox για το πρωτόκολλο ACW.
